AOAC ERP Gluten Assays - Dec 2018

11. Pre‐Test (Familiarization) using Control 1, Control 2, Control 3 and buffer 

Please notice that this ELISA procedure is different from other gluten ELISA procedures using R‐ Biopharm ELISA kits.  1. Please make sure that all components have reached room temperature (20 ‐ 25 °C, 68 ‐ 77  °F) before continuing.   2. The washing buffer is delivered as 10x concentrate. Please dilute before use according to  the instructions for use.  3. You will need the following components to perform the procedure described afterwards:  bag with microtiter plate, bag with pre‐plate, six standards, conjugate, wash buffer,  substrate/chromogen, stop solution   4. Open the microtiter plate bag which is  labeled with “Total Gluten”  and insert 3 strips into  the microwell holder. For the recommended plate layout please refer to the data return  sheet.  5. Six standards, three sample extracts, and the test kit buffer should be pipetted in duplicate  on a pre‐plate (uncoated)  to speed‐up the transfer to the coated plate. Therefore, pipette  at least 150 µl  of each standard, sample extract or buffer according to the pipetting  scheme on this plate which is clearly marked with “PRE‐PLATE” on the small site of the  plate and on the label of the bag.  6. By using an 8‐channel multi pipette, transfer  exactly 100 µl  of the solutions quickly to the  coated plate. Pre‐flush the tips with the standard or sample solution and use each tip only  once. In case of any doubts contact the manufacturer of this pipette or the study director.  Cover the plate.  Remember: the reaction starts when the first solution is added to the  coated plate. 7. Incubate for 20 minutes at room temperature (20 ‐ 25 °C, 68 ‐ 77 °F).  8. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell plate upside‐down vigorously (three  times) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all  wells with 250 µL of diluted washing buffer and pour out the liquid again. Repeat two  additional times. Washing is very important, thus please make sure to empty the wells  completely by vigorous tapping each time. If you are not sure whether you have washed  two or three times, wash once more.   9. Add 100 µL ready‐to‐use conjugate to each well and cover the plate.  10. Incubate for 20 minutes at room temperature (20 ‐ 25 °C, 68 ‐ 77 °F).  11. Pour the liquid out of the wells and tap the microwell plate upside down vigorously (three  times) against absorbent paper to ensure complete removal of liquid from the wells. Fill all  wells with 250 µL of diluted washing buffer and pour out the liquid again. Repeat two  additional times. Washing is very important, thus please make sure to empty the wells  completely by vigorous tapping each time. If you are not sure whether you have washed  two or three times, wash once more. 12. Add 100 µL of reddish Red Chromogen Pro solution to each well and cover the plate.  13. Incubate for 10 minutes  (20 ‐ 25 °C, 68 ‐ 77 °F) in the dark .

5